流式細胞儀檢測細胞凋亡：Heochst 33342/PI雙染色法
|
方法原理
|
經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經固定就不再是活細胞，而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。
流式細胞儀通常根據(jù)細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”，因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞?；罴毎玖先鏗oechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發(fā)生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細胞膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。
此外，還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。
根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。
|
|
實驗材料
|
細胞
|
|
試劑、試劑盒
|
Heochst 33342 染液 PBS 蒸餾水
|
|
儀器、耗材
|
400目篩網 流式細胞儀 冰箱
|
|
實驗步驟
|
一、細胞培養(yǎng)
懸浮生長的細胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ，終濃度為1 ug/ml； 37℃孵育7-10 min。
二、細胞收集
低溫500 ~ 1 000 r/min離心5min棄去染液。
三、染色
加入1.0 ml PI染液，4℃避光染色15 min。
四、過濾
400目的篩網過濾1次。
五、流式細胞儀分析
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長為352 nm，發(fā)射光波波長為400 ~ 500 nm，產生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
六、結果判斷
在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。
收起
|
|
注意事項
|
1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20 min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。
|
