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一、探針的標(biāo)記
1. 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
（1）待標(biāo)記探針 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
（6）總體積 10微升
（7）按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
2. 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
3. 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
4. 再加入89微升TE，混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。
5. 標(biāo)記好的探針*好立即使用，*長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
二、 探針的純化
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：
1. 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇，混勻。
2. 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過(guò)夜。
3. 在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
4. 在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過(guò)分干燥。
5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針*好立即使用，*長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。
三、EMSA 膠的配制
1. 準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺?好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。
重蒸水 16.2毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。
（3）80% 甘油： 625微升。
（4）10% 過(guò)硫酸銨 (ammonium persulfate) ：150微升。
（5）TEMED ：10微升
3. 按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。
四、EMSA結(jié)合反應(yīng)
1. 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)
陰性對(duì)照反應(yīng)：
(1）Nuclease-Free Water ：7微升。
（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。
（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。
（4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。
（5）總體積 ：10微升。
樣品反應(yīng)：
（1）Nuclease-Free Water ：5微升。
（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。
（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。
（4）標(biāo)記好的探針： 1微升。
（5）總體積： 10微升。
探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。
（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。
（4）未標(biāo)記的探針： 1微升。
（5）標(biāo)記好的探針： 1微升。
（6）總體積 ：10微升。
突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。
（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。
（4）未標(biāo)記的突變探針： 1微升。
（5）標(biāo)記好的探針： 1微升。
（6）體積 ：10微升
Super-shift反應(yīng)：
（1）Nuclease-Free Water：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。
（3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。
（4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。
（5）標(biāo)記好的探針：1微升。
（6）總體積 ：10微升。
2. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺(jué)到無(wú)法上樣，可以在無(wú)色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。
五、 電泳分析
1. 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
2. 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
3. 按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過(guò)30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
4. 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái)。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡。
5. 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。
收起
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