選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關(guān)鍵步驟之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等等。
基質(zhì)
基質(zhì)的性質(zhì)
基質(zhì)構(gòu)成固定相的骨架，親和層析的基質(zhì)應(yīng)該具有以下一些性質(zhì)：
1.具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。在與配體偶聯(lián)、層析過程中配體與待分離物結(jié)合、以及洗脫時(shí)的pH、離子強(qiáng)度等條件下，基質(zhì)的性質(zhì)都沒有明顯的改變。
2.能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合。親和層析的基質(zhì)應(yīng)具有較多的化學(xué)活性基團(tuán)，通過一定的化學(xué)處理能夠與配體穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，并且結(jié)合后不改變基質(zhì)和配體的基本性質(zhì)。
3.基質(zhì)的結(jié)構(gòu)應(yīng)是均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以使被分離的生物分子能夠均勻、穩(wěn)定的通透，并充分與配體結(jié)合。基質(zhì)的孔徑過小會(huì)增加基質(zhì)的排阻效應(yīng)，使被分離物與配體結(jié)合的機(jī)率下降，降低親和層析的吸附容量。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質(zhì)，以使待分離物有充分的空間與配體結(jié)合。
4.基質(zhì)本身與樣品中的各個(gè)組分均沒有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結(jié)合?；|(zhì)應(yīng)具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。
一般纖維素以及交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質(zhì)，其中以瓊脂糖凝膠應(yīng)用*為廣泛。纖維素價(jià)格低，可利用的活性基團(tuán)較多，但它對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用，另外它的穩(wěn)定性和均一性也較差。交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學(xué)穩(wěn)定性較好，但它們的孔徑相對(duì)比較小，而且孔徑的穩(wěn)定性不好，可能會(huì)在與配體偶聯(lián)時(shí)有較大的降低，不利待分離物與配體充分結(jié)合，只有大孔徑型號(hào)凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好。但它可利用的活性基團(tuán)較少，對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子也有較強(qiáng)的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個(gè)條件，它具有非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化等優(yōu)點(diǎn)，因此得到了廣泛的應(yīng)用。瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用*廣。
基質(zhì)的活化
基質(zhì)的活化是指通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。配體和基質(zhì)的偶聯(lián)，通常首先要進(jìn)行基質(zhì)的活化。
多糖基的活化
多糖基質(zhì)尤其是瓊脂糖是一種常用的基質(zhì)。瓊脂糖通常含有大量的羥基，通過一定的處理可以引入各種適宜的活性基團(tuán)。瓊脂糖的活化方法很多，下面介紹一些常用的活性基團(tuán)及活化方法。
1.溴化氰活化
溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨基（NH2）反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。
溴化氰活化的基質(zhì)可以在溫和的條件下與配體結(jié)合，結(jié)合的配體量大。利用溴化氰活化的基質(zhì)通過進(jìn)一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點(diǎn)是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會(huì)帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。
2.環(huán)氧乙烷基活化
這類方法活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙烷基。如在含有NaBH4的堿性條件下，1，4－丁二醇－雙縮水甘油醚的一個(gè)環(huán)氧乙烷基可以與羥基反應(yīng)，而將另一個(gè)環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。另外也可以用環(huán)氧氯丙烷活化，將環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。
這種活化方法的優(yōu)點(diǎn)是活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點(diǎn)是用環(huán)氧乙基活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件，pH為9~13，溫度為20~40? C。這樣的條件對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用。
上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有很多種活化方法如：N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化、三嗪（triazine）活化、高碘酸鹽（periodate）活化、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）活化、2,4,6－三氟5－氯吡啶（FCP）活化、乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazide）活化、二乙烯砜（divinylsulfone）活化等，總之，目前對(duì)基質(zhì)的活化方法很多，各有其特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇適當(dāng)?shù)幕罨椒ā?
聚丙烯酰胺的活化
聚丙烯酰胺凝膠有大量的甲酰胺基，可以通過對(duì)甲酰胺基的修飾而對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行活化。一般有以下三種方式：氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。另外在偶聯(lián)蛋白質(zhì)配體時(shí)也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝膠。
多孔玻璃珠的活化
對(duì)于多孔玻璃珠等無機(jī)凝膠的活化通常采用硅烷化試劑與玻璃反應(yīng)生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引進(jìn)氨基，再通過這些氨基進(jìn)一步反應(yīng)引入活性基團(tuán)，與適當(dāng)?shù)呐潴w偶聯(lián)。
間隔臂分子
在親和層析中，由于配體結(jié)合在基質(zhì)上，它在與待分離的生物大分子結(jié)合時(shí)，很大程度上要受到基質(zhì)和待分離的生物大分子間的空間位阻效應(yīng)的影響。尤其是當(dāng)配體較小或待分離的生物大分子較大時(shí)，由于直接結(jié)合在基質(zhì)上的小分子配體非常靠近基質(zhì)，而待分離的生物大分子由于受到基質(zhì)的空間障礙，使得其與配體結(jié)合的部位無法接近配體，影響了待分離的生物大分子與配體的結(jié)合，造成吸附量的降低。解決這一問題的方法通常是在配體和基質(zhì)之間引入適當(dāng)長度的“間隔臂”，即加入一段有機(jī)分子，使基質(zhì)上的配體離開基質(zhì)的骨架向外擴(kuò)展伸長，這樣就可以減少空間位阻效應(yīng)，大大增加配體對(duì)待分離的生物大分子的吸附效率。加入手臂的長度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。
引入間隔臂分子常用的方法是將適當(dāng)長度的氨基化合物NH2 (CH2)n R共價(jià)結(jié)合到活化的基質(zhì)上，R通常是氨基或羧基，n一般為2－12。例如Pharmacia公司生產(chǎn)的AH－Sepharose 4B和CH－Sepharose 4B就是分別將1,6－乙二胺，6－氨基乙酸與CNBr活化的瓊脂糖反應(yīng)引入間隔臂分子。二者的末端分別為氨基或羧基，通過碳二亞胺的縮合作用可以分別與含羧基或氨基的配體偶聯(lián)。
另外也可以通過進(jìn)一步的活化處理，生成N－羥基琥珀酰亞胺酯、環(huán)氧基等活性基團(tuán)直接與各種配體偶聯(lián)。引入間隔臂的基質(zhì)與配體結(jié)合時(shí)，配體就可以離開基質(zhì)一定的空間，從而可以減少空間位阻效應(yīng)，易于與待分離物質(zhì)結(jié)合。
配體
配體的性質(zhì)
親和層析是利用配體和待分離物質(zhì)的親和力而進(jìn)行分離純化的，所以選擇合適的配體對(duì)于親和層析的分離效果是非常重要的。理想的配體應(yīng)具有以下一些性質(zhì)：
1.配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力。親和力太弱，待分離物質(zhì)不易與配體結(jié)合，造成親和層析吸附效率很低。而且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但如果親和力太強(qiáng)，待分離物質(zhì)很難與配體分離，這又會(huì)造成洗脫的困難?？傊?，配體和待分離物質(zhì)的親和力過弱或過強(qiáng)都不利于親和層析的分離。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求盡量選擇與待分離物質(zhì)具有適當(dāng)?shù)挠H和力的配體。
2.配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性，也就是說配體與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對(duì)其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。
3.配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對(duì)其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對(duì)二者的結(jié)合沒有明顯影響。
4.配體自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性，在實(shí)驗(yàn)中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時(shí)可能的的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。
完全滿足上述條件的配體實(shí)際上很難找到，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體的條件來選擇盡量滿足上述條件的*適宜的配體。
根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specific ligand）和通用性配體（general ligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、**－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對(duì)于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實(shí)驗(yàn)。解決這一問題的方法是使用通用性的配體。通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對(duì)生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。
配體與基質(zhì)的偶聯(lián)
除了前面已經(jīng)介紹了基質(zhì)的一些活化基團(tuán)外，通過對(duì)活化基質(zhì)的進(jìn)一步處理，還可以得到更多種類的活性基團(tuán)。這些活性基團(tuán)可以在較溫和的條件下與含氨基、羧基醛基、酮基、羥基、硫醇基等多種配體反應(yīng)，使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。另外通過碳二亞胺、戊二醛等雙功能試劑的作用也可以使配體與基質(zhì)偶聯(lián)。以上這些方法使得幾乎任何一種配體都可以找到適當(dāng)?shù)姆椒ㄅc基質(zhì)偶聯(lián)。關(guān)于配體和基質(zhì)偶聯(lián)的具體實(shí)驗(yàn)操作可以參閱本書后面的實(shí)驗(yàn)部分或相應(yīng)的參考文獻(xiàn)。
配體和基質(zhì)偶聯(lián)完畢后，必須要反復(fù)洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。另外要用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ忾]基質(zhì)中未偶聯(lián)上配體的活性基團(tuán)，也就是使基質(zhì)失活，以免影響后面的親和層析分離。例如對(duì)于能結(jié)合氨基的活性基團(tuán)，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。
配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，通常要測定配體的結(jié)合量以了解其與基質(zhì)的偶聯(lián)情況，同時(shí)也可以推斷親和層析過程中對(duì)待分離的生物大分子吸附容量。配體結(jié)合量通常是用每毫升或每克基質(zhì)結(jié)合的配體的量來表示。測定配體結(jié)合量的方法很多，下面簡單介紹幾種：
1.差量分析：根據(jù)加入配體的總量減去配體與基質(zhì)偶聯(lián)后洗滌出來的量即可大致推算出配體的結(jié)合量。當(dāng)配體可以用光譜法準(zhǔn)確定量時(shí)，這種方法還是相當(dāng)準(zhǔn)確的。
2.直接光譜測量：對(duì)于能夠吸收250nm以上波長的配體，可以直接用光譜法測定與基質(zhì)結(jié)合的配體的量。
3.凝膠溶解：通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛z溶解，如75 ?C下與酸或堿作用，而后直接用光譜法測量。
4.酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基質(zhì)釋放出配體或配體的裂解物進(jìn)行分析。
5.2,4,6－三硝基苯磺酸鈉（TNBS）分析：利用TNBS與未結(jié)合配體和結(jié)合某些配體的基質(zhì)作用呈現(xiàn)不同的顏色，可以計(jì)算出配體結(jié)合量
6.元素分析：如果配體中含有某種特別的元素，通過元素分析就可以確定配體結(jié)合量。
7.放射性分析法：偶聯(lián)中加入一定量帶有同位素的配體，通過放射性分析確定配體結(jié)合量，這是一種非常靈敏的方法。
影響配體結(jié)合量的因素很多，包括基質(zhì)和配體的性質(zhì)、基質(zhì)的活化方法及條件、基質(zhì)和配體偶聯(lián)反應(yīng)的條件等等。例如通常溴化氰活化的基質(zhì)的活性基團(tuán)比環(huán)氧基活化的基質(zhì)多，配體結(jié)合量可能較大。在用溴化氰活化時(shí)，增加溴化氰的量及反應(yīng)的pH，可以增加基質(zhì)上活化基團(tuán)的量，從而增大配體結(jié)合量。偶聯(lián)過程中增加配體的量及增大反應(yīng)的pH，也可以增大配體結(jié)合量。實(shí)驗(yàn)中通常希望配體結(jié)合量較高，但應(yīng)注意增加配體結(jié)合量應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，還要考慮到其它因素的影響。因?yàn)樘岣吲潴w的結(jié)合量不等價(jià)于提高親和吸附劑的吸附容量，配體結(jié)合量只是影響親和吸附劑吸附容量的一個(gè)因素，還有很多因素，如基質(zhì)、配體以及待分離物質(zhì)本身的性質(zhì)，配體在基質(zhì)的結(jié)合情況以及后面要介紹的實(shí)驗(yàn)操作條件等都可能對(duì)親和吸附劑的吸附容量產(chǎn)生很大的影響。例如增大配體的結(jié)合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配體結(jié)合量的條件可能會(huì)影響配體的結(jié)構(gòu)，降低配體和待分離物質(zhì)的親和力，這樣反而會(huì)降低親和吸附劑的吸附容量。實(shí)際影響親和吸附劑吸附容量的因素是非常復(fù)雜的，各種因素的影響都不是**的，要獲得較高的吸附容量往往要考慮很多因素，并通過實(shí)驗(yàn)摸索來選擇合適的條件。
目前已有多種活化的基質(zhì)以及偶聯(lián)各種配體的親和吸附劑制成商品出售，可以省去基質(zhì)活化，配體偶聯(lián)等復(fù)雜的步驟。使用方便，效果好，但一般價(jià)格昂貴。
親和吸附劑的再生和保存
親和吸附劑的再生就是指使用過的親和吸附劑，通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ谷コ皆谄浠|(zhì)和配體（主要是配體）上結(jié)合的雜質(zhì)，使親和吸附劑恢復(fù)親和吸附能力。一般情況下，使用過的親和層析柱，用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情況下，尤其是當(dāng)待分離樣品組分比較復(fù)雜的時(shí)候，親和吸附劑可能會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的不可逆吸附，使親和吸附劑的吸附效率明顯下降。這時(shí)需要使用一些比較強(qiáng)烈的處理手段，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當(dāng)?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌?。但如果配體是蛋白質(zhì)等一些易于變性的物質(zhì)，則應(yīng)注意處理時(shí)不能改變配體的活性。
親和吸附劑的保存一般是加入0.01%的疊氮化鈉，4℃下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。應(yīng)注意不要使親和吸附劑冰凍。
